INGENIERÍA GENÉTICA Y SALUD IV. TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS.

            Electroforesis en gel.

            La electroforesis es una de las técnicas más utilizadas para separar cualquier tipo de macromoléculas que estén dotadas de carga eléctrica. Cuando una disolución de este tipo de macromoléculas es sometida a un campo eléctrico, las partículas cargadas negativamente emigrarán hacia en ánodo y las de carga positiva lo harán hacia el cátodo. Si existe una diferencia significativa de tamaño entre las moléculas, su movimiento se realizará a diferentes velocidades y el fenómeno será apreciable si el movimiento de las partículas se realiza contra la gravedad. Pero el retardo será aún más evidente si el medio en el que se obligan a emigrar a los polímeros se trata de un gel áltamente viscoso (gel de agarosa, por ejemplo). Así, los fragmentos de ADN obtenidos por la acción de una enzima de restricción podrán ser separados unos de otros en función de su masa molecular, que a fin de cuentas indica su longitud o número de nucleótidos.

            En el caso del ADN, debido a la existencia de grupos fosfato ionizados, la carga neta de cada polinucleótido es negativa, por lo que todas las moléculas emigrarán al polo positivo. Al cabo de unos minutos los polinucleótidos más ligeros estarán cerca del ánodo y los más pesados estarán más alejados. Se desconecta entonces el campo eléctrico y se procede a teñir los fragmentos de ADN. Es frecuente usar colorantes fluorescentes (que emiten luz cuando son iluminados con radiación ultravioleta) y de este modo aparecen una serie de bandas que revelan la posición de los diferentes polinucleótidos (en el caso de que se hubiera sometido a electroforesis un solo tipo de polinucleótido, aparecería una sola banda, y si se introduce una muestra compleja, por ejemplo, el ADN de un ser eucariota sometido a restricción, aparecería un espectro continuo) . Si en otro carril sometido al mismo proceso se han introducido fragmentos de ADN de tamaño conocido, podrán ser usados como calibrador y los trozos de ADN problema podrán ser deducidos con facilidad. Esto permitirá también extraer muestras de alguna de las bandas, y purificar polinucleótidos de tamaño deseado.

            La electroforesis también ha sido usada para secuenciar genes. Dado que existen enzimas que cortan un fragmento de ADN por nucleótidos concretos (adenina, por ejemplo), se puede cortar un gen en trozos que contengan adenina en el extremo 5’. Los pedazos son unidos a trazadores radiactivos e introducidos en el gel para ser sometidos a electroforesis. Al cabo del rato, aparecerán unas bandas, correspondiendo sólo a los fragmentos que comiencen por adenina. Tras ser calibrados los pedazos de ADN, se conocerá la posición exacta de todas las adeninas en el gen. Se repite la operación con el resto de nucleótidos, y se consigue su secuencia completa.

            Hibridación con sondas.

            Cuando el ADN es sometido a altas temperaturas o a ciertos tratamientos químicos, se produce una rotura de los enlaces por puentes de hidrógeno que mantenían unidas las dos hebras y la doble hélice. Esta desnaturalización, como se ha dicho anteriormente es reversible, de modo que al bajar de nuevo la temperatura se produce la reasociación de las dos hebras complementarias. Esta renaturalización puede tener lugar también entre dos hebras de ADN de diferente procedencia, pero que contengan algunos sectores complementarios, y se conoce como hibridación de ácidos nucléicos. También es el fundamento para la construcción de sondas para la identificación de ADN.

            Las sondas son segmentos cortos de ADN monocatenario con una secuencia conocida (también puede ser ARN) que deben estar trazados mediante algún nucleótido radiactivo, o que posean nucleótidos modificados de algún modo que permita revelar la existencia o no de hibridación, en algunos o en todos los sectores. Por otro lado, el ADN problema es sometido a digestión mediante enzimas de restricción, posteriormente separados mediante electroforesis en gel, y los fragmentos obtenidos transferirlos a materiales especiales de nitrocelulosa o nylon, donde se añadirán las sondas.

            En los últimos años se ha anunciado la construcción de “biochips” para identificaciones genéticas, basadas en la hibridación con sondas de ADN trazado, que permitiría identificar la existencia o no de determinadas secuencias en genes desconocidos, en cuestión de minutos. Un uso obvio de estos aparatos sería la detección precoz de genes causantes de enfermedades hereditarias en pacientes con antecedentes familiares. También podrían ser usados en la prevención de diferentes cánceres. (Un tumor comienza a desarrollarse cuando una célula se ha saltado todos los mecanismos de control que regulan la mitosis, que a su vez sucede por haber sufrido mutaciones una serie de genes conocidos como protooncogenes y genes supresores de tumores).