INGENIERÍA GENÉTICA Y SALUD VI. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).

            Existe una técnica que permite de manera rutinaria la obtención rápida de un número ilimitado de copias de un segmento de ADN. Se denomina PCR (polymerase chain reaction). La PCR se lleva a cabo in vitro, y utiliza la enzima ADN polimerasa, la muestra de ADN que se quiere amplificar, desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, etc) y oligonucleótidos (en exceso) que actúan de cebadores para que la polimerasa pueda trabajar y que son complementarios a secuencias situadas en los extremos 3’ del segmento de ADN que se pretende copiar ( siendo necesario por tanto, conocer la secuencia del ADN a copiar).

            La PCR es rápida y relativamente sencilla, pero ingeniosa. La muestra de ADN es desnaturalizada por calentamiento. Posteriormente, se permite la hibridación de los dos segmentos monocatenarios con los oligonucleótidos que actuarán como cebadores. Posteriormente se permite a la ADN polimerasa que efectúe la copia de ambos segmentos. El ADN habrá sido duplicado. No importa que en la muestra existiesen otros ADN diferentes, ya que al no disponer de cebadores, no habrán sido replicados, sino que se habrán vuelto a reasociar. Los ADN bicatenarios obtenidos son desnaturalizados de nuevo e hibridados con los cebadores, con lo que la polimerasa habrá construido en el segundo ciclo cuatro cadenas completas y gemelas. Dado que en cada ciclo se dobla el número de segmentos de ADN, el número de estos va aumentando exponencialmente, a razón de 2 elevado a n, siendo n el número de ciclos.

            La utilización de una ADN polimerasa estable a altas temperaturas, purificada a partir de la bacteria termófila Thermus aquaticus, permite efectuar muchos ciclos con una única adición de enzima, y debiéndose bajar la temperatura en cada ciclo, únicamente para permitir la hibridación de los ADN monocatenarios con los cebadores. Este hecho permite la automatización, pero es que además, la enzima utilizada (aislada en una bacteria termófila) presenta una actividad óptima a 75º centígrados, y a esta temperatura el apareamiento entre los cebadores y los extremos 3’ del ADN deseado resulta más específico que a temperaturas más bajas (como la óptima de E coli, unos 37º). En consecuencia es menos probable que los cebadores hibriden con secuencias contenidas en segmentos de homología imperfecta, lo que tiene bastante importancia cuando se trabaja con fragmentos de un genoma completo. Encontrar una aguja en un pajar es sencillo, si pueden crearse miles de millones de copias de la aguja en unos minutos.

                Aplicaciones de la PCR.

            Muchas de las aplicaciones de la PCR están todavía por descubrir, pero la técnica ha sido ya aplicada en la obtención de nuevos datos sobre la estructura de los genes, de ARN, de genomas completos, e incluso en el prometedor campo de la computación con “ordenadores” de ADN. Se citarán algunos ejemplos.

            Determinación de la estructura de mutaciones. Una vez que un gen ha sido obtenido, dos cebadores pueden utilizarse para amplificar los segmentos genómicos correspondientes de varios individuos de una especie. El análisis de las secuencias puede revelar la naturaleza de una mutación (cambio de bases, delección, inserción, etc). Dada la facilidad con que puede ser llevado a cabo este proceso, lo convierte en un instrumento de diagnóstico adecuado para detectar la presencia de genes mutantes causantes de enfermedades genéticas, hereditarias o no. Las distintas clases de mutaciones pueden también detectarse si se emplean cebadores específicos de formas mutantes particulares de un gen determinado.

            Detección de agentes infecciosos. La presencia de genomas de virus o bacterias pueden ser detectados, aún teniendo en cuenta que la cantidad de ADN de la célula hospedadora es enormemente mayor. Basta con conocer la secuencia de los ADN extraños, fabricar los cebadores correspondientes, etc. Existen ya diagnósticos de infección del VIH que usan la PCR.

            Amplificaciones de segmentos de ADN dentro de células. Se ha conseguido ya crear enormes cantidades de copias de segmentos de ADN en células somáticas y células germinales humanas. Con este procedimiento puede medirse directamente la velocidad de recombinación meiótica en las células madre de gametos.

            Análisis de la histocompatibilidad de dos individuos. Una vez localizados y secuenciados los genes responsables del complejo principal de histocompatibilidad de macrófagos y otras células inmunitarias, se pueden someter a amplificación por PCR en dos individuos (donante y receptor) de cara a comparar la viabilidad del trasplante de un órgano determinado.

            Ordenadores de ADN. Todas las actuales máquinas de cómputo trabajan por medio de componentes electrónicos de silicio. Sin embargo, se trabaja ya en la construcción de ordenadores capaces de realizar cálculos por interacción de moléculas en disolución. Así, ha nacido lo que se conoce como ordenadores de ADN. En ellos, la entrada y salida de datos se realiza con polinucleótidos como soporte físico, y las piezas que los integran son enzimas. Una de las ventajas de esta nueva raza de computadoras es que proporcionan un almacenamiento de datos masivo. Los actuales ordenadores guardan los datos como secuencias de ceros y unos, en forma de imanes polarizados o no (disquetes), condensadores cargados o descargados (discos duros), o muescas realizadas con láser en un sentido o en otro (CD ROM). Pero en los ácidos nucleicos cada cero o cada uno, ocuparía el tamaño de un solo nucleótido, de modo que un solo gramo de ADN almacenaría, en forma de secuencia ordenada de bases nitrogenadas, la información contenida en mil millones de CD-ROM. Su principal desventaja es, hoy por hoy su rápida pérdida de datos (mutaciones, al fin y al cabo), y sobre todo su lenta velocidad de cómputo. Para solucionar el primer problema, se ha propuesto incorporar a los ordenadores de ADN los sistemas de reparación de ADN con que cuenta cualquier célula eucariota, y para solucionar el segundo, la simbiosis entre los componentes procesadores de los ordenadores clásicos y la memoria en forma de ADN, uniendo así la inmensa capacidad del ADN y la alta potencia de los procesadores de silicio. El papel de la PCR en este tipo de máquinas es obvio; crear tantas copias como se desee de cualquier “programa” o “archivo” almacenado en un ADN.